1　范圍

本標準規范了農用硅酸鹽細菌菌種的特征、要求、檢驗方法、評價方法以及菌種的純化、復壯和保藏。

本標準適用于農用微生物菌劑和微生物肥料生產中使用的硅酸鹽細菌菌種。

2　規范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的新版本。凡是不注日期的引用文件，其新版本適用于本標準。

GB/T 17419-1998   含氨基酸葉面肥料

NY/T 301-1995  有機肥料鉀的測定

NY/T 798-2004  復合微生物肥料

3　術語

硅酸鹽細菌菌種 Silicate-Dissolving Bacteria Culture

是指一類在土壤中能通過自身的生命活動，分解硅鋁酸鹽類礦物，釋放鉀素營養，改善植物的營養條件，并具備生產應用性能的細菌純培養物。

4　菌種特征

硅酸鹽細菌菌種包括膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）和土壤芽孢桿菌（Bacillus edaphicus）兩個種。

4.1　細胞形態

營養體：粗長桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色反應不定，產生聚β-羥基丁酸鹽（PHB）顆粒。在培養基 A.1 上(參見附錄 A )菌體大小為（1.0 ～ 1.2）× （2.5 ～ 7.0）μm ，菌體周圍有厚莢膜。

芽孢：壁厚，橢圓形，中生或近端生，芽孢囊不膨大或微膨大。

4.2　菌落形態

在 A.1 培養基平板上：菌落圓形，無色，隆起，膠質粘稠，透明或半透明，邊緣整齊。

4.3　生物學特征

好氧或兼性厭氧生長，水解淀粉，接觸酶反應陽性，氧化酶和卵磷脂酶反應陰性，在無氮培養基（參見附錄A.2）上生長良好，生長溫度10 ℃ ～ 45 ℃。

5　要求

5.1 菌種要求純培養物，無雜菌。

5.2 硅酸鹽細菌菌種技術指標見表1。

表1     硅酸鹽細菌菌種技術指標

6　檢驗方法

6.1　菌種純度檢驗

在適宜培養基上培養，觀察菌落和菌體形態，若有雜菌丟棄或對其進行純化，純化方法見 8.1.2  。

6.2　解鉀能力的測定

鉀相對增加量的測定方法見附錄 B。 

6.3　發酵代謝產物測定

6.3.1　發酵條件

在適宜培養條件下，發酵周期結束后取樣測定發酵液中代謝產物的含量。以不接種的發酵培養液作對照。發酵培養基見附錄 A.3 。

6.3.2　植物激素的測定

見附錄 C 。

6.3.3　游離氨基酸的測定

見附錄 D 。

6.3.4　有機酸的測定

見附錄 E 。

6.4　芽孢存活率測定

6.4.1測定方法

菌懸液在 65 ℃ 條件下恒溫 30 min 殺死營養體 ，制成芽孢懸液。芽孢懸液 80 ℃ 恒溫水浴處理 10 min ，將處理前和處理后的芽孢懸液稀釋涂布在適宜培養基上，適宜條件下培養 2 d ～ 4 d ，計菌落數。三次重復。活菌數測定方法應符合NY/T 798-2004中5.3.2的要求。

6.4.2芽孢存活率計算

按式(1) 計算

                      ……(1)

式中:

 -- 芽孢存活率（% ）

n0 -- 處理前芽孢懸液的菌落平均數（cfu/mL）

n1  -- 處理后芽孢懸液的菌落平均數（cfu/mL）

6.5　發酵周期的檢驗

適宜生產條件下，當發酵液中的菌體數量達到 108 cfu / mL 以上且有 80 %  以上的營養體形成芽孢為發酵周期終止。

7　評價方法

7.1　菌株符合表1中的各項指標，可以作為優良生產菌株。

7.2　表1中其他三項符合要求，而發酵代謝產物僅兩項達到要求或其中一項達到要求的兩倍，也可作為生產菌株。

7.3　當硅酸鹽細菌菌種用做生產液體劑型時，對耐熱能力不做要求。

8　菌種純化、復壯和保藏

8.1　菌種分離與純化

8.1.1　分離

將土壤或其他樣品制成菌懸液，稀釋后涂布 A.1 培養基平板上，適宜條件下培養 2 d ～ 4 d ，挑取符合硅酸鹽細菌菌種特征的菌落進行純化。

8.1.2　純化

在適宜的培養基上連續劃線培養觀察，直至菌落形態一致，鏡檢菌體大小整齊，無雜菌。

根據硅酸鹽細菌的特征進行菌種確認。

8.2　復壯

菌種生長速度下降、菌體形態出現異常、主要功能指標下降時需要進行菌種復壯。

具體操作方法是將菌種接種在適宜的土壤或載體中，也可將菌種轉接在含有土壤浸出液的培養基上 2 ～ 3 代；培養一段時間后再分離，挑取與原菌種特征一致的菌落，純化，同時按表5.1中的要求進行測試。

8.3　菌種保藏

8.3.1　短期保藏

常用的保藏方法是斜面保藏法，挑選菌苔豐滿的斜面菌種置于4 ℃ ～ 8 ℃ 下保存，三個月左右轉接一次。

8.3.2　長期保藏

菌種形成芽孢后進行長期保存，采用兩種或兩種以上的方法保存，并制備多個備份。常采用的保藏方法有：凍干管法，甘油管法，石蠟油覆蓋法，砂土管法等。

附　錄　A

（資料性附錄）

選擇培養基

A.1　硅酸鹽細菌培養基

蔗糖：5.0 g

Na2HPO4：2.0 g

MgSO4 · 7H2O：0.5 g

CaCO3：0.1 g

FeCl3 · 6 H2O：5 mg

pH：7.5 ～ 8.5

瓊脂：18.0 ～ 20.0 g

蒸餾水：1.0 L

A.2　無氮培養基（阿須貝（Ashby）培養基）

甘露醇：10.0 g

KH2PO4：0.2 g

MgSO4· 7H2O：0.2 g

NaCl：0.2 g

CaCO3：5.0 g

CaSO4· 2H2O：0.1 g

pH：7.0 ～ 7.5

瓊脂：18 .0～ 20.0 g

蒸餾水：1.0 L

A.3　測定發酵代謝產物用發酵培養液

玉米淀粉：8.0 g

豆餅粉：2.0 g

K2HPO4：2.0 g

MgSO4 · 7H2O：0.5 g

MnSO4 · H2O：0.5 g

CaCO3：0.1 g

FeCl3 · 6 H2O：5 mg

pH：7.0 ～ 7.5

蒸餾水：1.0 L

附　錄　B

（資料附錄）

解鉀能力測定

B.1　原理

硅酸鹽細菌能夠分解硅鋁酸鹽礦物，將礦物態鉀轉變為可溶性鉀為菌體自身或植物所利用，通過測定培養液中鉀含量的相對增加量來確定菌種的解鉀能力。

B.2　材料和試劑

B.2.1　材料

含鉀礦石粉：鉀長石，磨碎，粒徑 0.075 mm 以下。

B.2.2　試劑

20% H2O2 溶液

B.3　培養液

B.3.1　種子液

淀粉：5.0 g

酵母膏：1.0 g

K2HPO4：2.0 g

MgSO4· 7H2O：0.5 g

CaCO3：0.1 g

FeCl3 · 6 H2O：5 mg

pH：7.5 ～ 8.5

蒸餾水體積：1.0 L

B.3.2　發酵液

蔗糖：10.0 g

MgSO4· 7H2O：0.5 g

(NH4)2· SO4：0.2 g

NaCl：0.1 g

CaCO3：0.1 g

鉀長石粉：5.0 g

pH：7.2 ～ 7.5

蒸餾水體積：1.0 L

B.4　測定方法步驟

B.4.1　鉀礦石處理

鉀礦石粉用 20% HCl 溶液淋洗（酸洗，洗去鉀和緩效鉀），再用蒸餾水淋洗至中性。

B.4.2　種子液制備

挑取一環活化好的斜面菌種接入50 mL 種子培養液中，150 r/min 搖床，適宜溫度下培養到對數期，菌體含量不少于 2×108cfu/ mL 。

B.4.3　發酵液制備

500 mL 三角瓶加入解鉀發酵液 95 mL，高壓滅菌備用。接入種子液 5 mL，同時做加入等量滅活種子液的發酵液為對照，在28 ℃、150 r/min 條件下 培養 7 d 。設置三個重復。

B.4.4　發酵液的處理 過氧化氫灰化法

將全部發酵液轉入蒸發皿中，在水浴鍋中濃縮至 10 mL 左右，加 2.0 mL H2O2 溶液 ，繼續蒸發，并不斷攪動，反復加 20% H2O2 溶液幾次至粘性物質完全消化。3500 r/min  離心 10 min ，將上清液收集在 50 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，然后測定溶液中鉀含量。

B.4.5　鉀的測定

按 NY/T 301-1995 規定執行。對第6章試樣的制備、第7章分析步驟中的7.1和7.3標準曲線繪制進行修改。

B.4.5.1　試樣的制備

按 B.4.4 的要求執行。

B.4.5.2　分析步驟

試樣溶液制備 參見NY/T 301-1995 7.1，將稱取試樣 5.00 g 改為吸取試樣 5.00 mL 。

吸取鉀標準溶液 0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，7.50，10.00 mL 分別置于 8 個 50 mL 容量瓶中。加 10.00 mL 硝酸溶液，用水定容。此溶液 1 mL 中含鉀（K）0，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，15.00，20.00 μg 的標準溶液系列。在火焰光度計上用空白溶液調節儀器零點，以標準溶液系列中的至高濃度的標準溶液調節儀器滿刻度至 80 分度處，測量其他標準溶液，記錄儀器示值。根據鉀濃度和儀器示值繪制校準曲線或求出直線回歸方程。

B.5　鉀相對增加量

按式（2）計算

                      ……（2）

式中：

a  — 鉀相對增加量（%）

ρ0 — 試樣中鉀的含量（mg/L）（未接種發酵液的對照）

ρ1 — 試樣中鉀的含量（mg/L）（接種發酵液）